----- Original Message -----
From: Reinhold Kiehl
To: Thomas Misgeld
Sent: Thursday, May 15, 2014 1:23 PM
Subject: Einige Bemerkungen zu Re: Nature Medicine - Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo

Guten Tag Herr Thomas Misgeld !
Noch einmal meinen Dank für das Zusenden Ihrer Arbeit. Da ich hier in Straubing keine Bibliothek zur Verfügung habe, kann ich mir nur über das Netz und Kollegen "Informationen" zukommen lassen.
Habe durch Ihre und Ihrer Coautoren Arbeit geschaut und einige Anmerkungen, welche vielleicht durch meine etwas "ferne" Sicht auf diese Ihre neue "Methoden" und "Materialien" zu erklären sind. Ich denke, daß ich mir diese Arbeit "in vivo" in den Labors ansehen muß, daß "suppl" mir anschauen sollte, welches leider nicht Ihrem Mail beilag...
---- Wie ich lesen kann, ist diese "Tier-Studie" durch die Regierung von Oberbayern genehmigt worden.----
In Ihrer Überschrift wird suggeriert, daß "Mitochondriale Redox Signale während neuronaler Physiologie und Pathologie in VIVO" analysiert werden !
Mein Verständnis der Arbeit in kurzer Zusammenfassung.
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--The approach is based on transgenic expression of glutaredoxin-1 (Grx1)-reduction-oxidation sensitiv GFP2 (roGFP2), a biosensor for the glutathione redox potential = redox sensor, not susceptible to pH-changes. GFP = um einiges größer als ein "Proton" !!!
--Mouse models of ALS and spinal cord injury................... sehr weit weg vom normalen "Leben"
--Parallel measurements of mitochondrial membrane potential and pH, Ca2+-levels.......... Ca-deposits, incl. ???
--Redox signals in single mitochondria..........
physiological conditions: mitochondrial glutathione redox potential in neurons was tigthly regulated and independent of organelle location or movement; -
contraction dependent on respiratory chain activity and characterized by reversible changes to the mitochondrial membrane potential, pH and glutathione redox state: electrical stimulation, nerve crash or chronic neurodegeneration: stress - damage-oxidation: spread along axon - preceeded by Ca2+-rise, axon - mitochondria - ............ in vivo ???????
Ca2+-influx initiated the spread of mitochondrial oxidation and subsequent organelle pathology. In contrast to reversible contractions, axotonomy-induced permanent alterations - pore opening not prevented by ROS scavenging....... new dissection.... ??? In VIVO ???
Fig.1a-c) and Suppl Table1,Fig.1 - no neurological abnormalities... - excitation 408 and 488 nmm, calibration with exogeneous application of H2O2 -
Fig.1d,e) - H2O2: 6.25 - 800 microM -
reducing agent: DTT - partial oxid. of the sensor below baseline conditions - VIDEO1 - redox state in resting and moving axonal mitochondria(Fig.1f)
in some mitochondria: spontaneous oxidative bursts (Fig.2a,b and Suppl.Video2)
Bungarotoxin (BTX)mice
0.5 mM DTT reducing, NR normal Ringer Solution, oxidant H2O2:

NMJs - 2.6... R/RDTT/H2O2 (microM) n= 15-25 synapses per conc from 4 mice, DTT = 500microM, H2O2 = 10 - 1000 microM
Glutathione Redox Potential in different populations of axonal mitochondria/normalized to resting mitochondria ???
Fig.1e: Synapse f) Axon --- Sections / Slices ..... In Vivo ???
Fig.2: contracting = determination by the writer........ R/Ro .... (488 nm)
b) oxid. vs shape ??? ..... onset ..... shape factor ....
d) potential sensitive probe TMRM load F/Fo membrane potential - glutathione redox potential during contraction: determinated....
e/f) sterni explant... rAAV-mito-SypHer... pH during contraction ??? .... (408 nm)
g/h) ........ mito R-GECO1 matrix Ca2+ during contraction ???
i/J) i) matrix pH in NR and during genipin (100 microM) treatment J) matrix potential...... Genipin crosslinking, Carbodiimide..... ????
Inhibition of mitochondrial complex1 by rotenone decreased the frequency of contractions in a dose dependent manner (0.1 nM rotenone... 0.51 +- 0.22, 100 nM rotenone... 0.13 +-0.05) ----- ??? active e-transport ???
??? Uncoupling proteins inhibitor genipin (100 microM) reduced acification and accelerated repolarization of mitochondria ...no Ca2+-signals...
Es fehlen sämtliche Medien ! Bedingungen ! ... NR Fig.3a Next: contraction ???? by what.....
...slight oxidative shift (0.45 vs 0.49).......... ???
...ox. H2O2 increased contraction frequency, ... red. DTT, MitoQ, MnSOD reduced contraction frequency...
...............contraction might be stress induced reaction of mitochondria.......... ???
---------- Test on axons increased neuronal activity --- ALS model (SOD1 mice) Fig.3b-e, Suppl.Fig.2
ALS model mice with prolonged disease, axonal mitochondria were irreversibly rounded and oxidized.......
S.4 - Models of trauma: Suppl. Fig.3 and Video4/5 ??? high-level mitochondrial oxidation and acidification - mitos rounding or fragmentation after transection ..... as well as increase in matrix calcium...
Suppl. Fig.4/Fig.5 --- exogenic H2O2 doses - mitochondrial oxidation in minutes, lastet for 4 hrs
--- dose to lesion oxidized mitos ca. 5 s, along the axon ca. 2.4 microm/s - 15 qum - +swelling, fragmentation...
Fig.4) mitochondria chape changes and oxidation in lesioned spinal axons
NAC (1mM N-acetyl-cysteine), MnSOD, transgenic overexpr. of MnSOD, Ca2+ spread along transected axons, EGTA, depletion of extracellular Ca2+ ???, CypD-, cyclophilin D-deficient mice......... ???
Mol.Mechanisms: mitos ox. and damage by oxidative tress ?
Fig.4d) Transgenic overexpression of MnSOD or application of NAC (1mM) prevented mitochondrial oxidation but not structural damage: shape change without redox changes ??? not to see...
Ca2+ influx local as damage trigger ?
with Thy1-TN-XXL mice: Ca2+- sensor fluor... - laser transsection - localized Ca2+ influx along axon, ahead of the subsequent mitochondrial redox changes ??? not to see... Video7
Fig.4g) Intra-axonal calcium rise depends on extracellular Ca2+ and is sufficient for the induction of mitochondrial oxidation and damage........
Diskussion - Biosensor -
Ca2+ - central second messenger in neurons - ROS as similarly complex signal carriers.....
....traced by genetically encoded redox indicators (GERIs) --- roGFPs, Hyper, ------------ neurodegenerative Disorders ------------
..... Glutathione-redox pair: Grx1 - roGFP2 sensor - We: ---- in vivo imaging, such as cerebral cortex (Suppl.Fig.6) ---------
mitochondrial dynamics, redox signaling and bioenergetics at the single organelle level:
Shape, redox state, pH, calcium levels and membrane potential
... for instance: Mitochondrial contractions: ex/endo - stressors mild oxidations that prime for contraction ??? then contraction is initiated by rapid depolarisation, that is probably mediated by spontaneous ion flux (???) and charge equilibrium across the inner mitochondrial membrane:
K+ or Na+ but less likely Ca2+-ions or H+ .................. ???????
... next, the reduced mitochondrial potential leads to acceleration of electron transport and, as a result, to increased proton pumping out of the matrix, which explains the alkaline spike observed with the mitochondrial pH-sensor ????????. Increased activity of the electron transport chain and subsequent ROS generation could induce ????? activation of uncoupling proteins ???????? that mediate sustained matrix acidification and potential decreases ?????? ---------- contractions act as "safety fuse" for mitochondria ??????
Mitochondrial linkage to disease: pulse, pH flashes, superoxide bursts, --- Ca2+ has a central role in mitochondrial damage, permeability transition - oxidation plus fragmentation =
1.) Ca2+ - alterations 2.) redox- driven alterations.........
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Grüß Sie noch einmal Herr Kollege !
Mein Hauptkritik-Punkt: Ihre Kollegen und Sie behaupten, daß die Studien "in vivo" Ergebnisse liefern. Frage: Welche "in vivo" Ergebnisse, für wen oder was?
Ich erwarte normalerweise "Ergebnisse", welche direkt in die Behandlung von Patienten einfließen können: z.B. aus Blut von Patienten, oder aus gut definierten funktionierenden isolierten Zellen, Organellen, Organen... in natürlicher Umgebung, Einbettung...etc.
Die gezeigten Messungen an "euthanisierten", sectionierten, "veränderten" Mäusen, Teilen, sind nach meiner Sicht weit weg von "normalen" in vivo- Versuchen für Patienten.
Nach meiner Sicht kann man diese Ihre Messungen sehr viel einfacher, ohne (oder mit sehr minimierter Anzahl von wirklich nötigen Tierversuchen) generieren -
Wenn Sie sich meine und meiner Mitarbeiter, oder Kollegen,... Arbeiten anschauen, so sehen Sie, daß wir "in vivo" Ergebnisse erhalten, welche direkt in die Therapie und Behandlung von Patienten einfließen können: Diese "Forschung" sollte einfach, mit den einfachsten Mitteln, schnell zu verwertbaren, anwendbaren Ergebnissen für eine "Medikation" führen.
Anderer Kritikpunkt: Es sind sehr viele Annahmen und Behauptungen, Schlußfolgerungen, Spekulationen in der Arbeit - nach meiner Kenntnis/Ansicht.
Es sind sehr viele Labors involviert, sehr viele Kollegen, Mitarbeiter, sehr viele Teile, .... wodurch der Einblick, der "Überblick" verlohren gehen kann... die "Standardisierung" leiden kann......etc.
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Ansonsten, wie gesagt, mir fehlen die Suppls - vielleicht können Sie mir dieses noch zukommen lassen,...müßte mir das "Ganze" im Labor ansehen - vielleicht können wir das ja "terminieren", einen Termin ausmachen: Sie können mich vielleicht besser im Labor "überzeugen"... auch wenn ich kein Blut sehen kann, wenn ich bei der Blutabnahme wegsehen muß...
Mit besten Grüßen
Reinhold Kiehl
http://www.rki-i.com/verk2/k001u005s001.htm
Diese Anmerkungen ohne das Supplement - welches mir leider nicht zur Verfügung steht -
----- Original Message -----
From: "Reinhold Kiehl" <kiehl@rki-i.com>
To: "Thomas Misgeld" <Thomas.Misgeld@lrz.tu-muenchen.de>
Sent: Tuesday, May 06, 2014 11:08 AM
Subject: Re: Nature Medicine - Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo

> Danke !
> Werde mir die Arbeit zu Gemüte führen.
>
> RKI.
>
> ----- Original Message -----
> From: "Thomas Misgeld" <
Thomas.Misgeld@lrz.tu-muenchen.de>
> To: "Reinhold Kiehl" <
kiehl@rki-i.com>
> Sent: Monday, May 05, 2014 10:00 PM
> Subject: Re: Nature Medicine - Multiparametric optical analysis of
> mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo
>
>
> Mit besten Gruessen,
>
> Thomas Misgeld
>
>
> Am 2014-05-03 18:53, schrieb Reinhold Kiehl:
>> Sehr geehrte Kollegen !
>>
>> Könnten Sie mir bitte Ihren Artikel über das
>> Mitochondrien-Redox-Signalling zukommen lassen?
>>
>> Mit freundlichen Grüßen
>> Prof.Dr.Reinhold Kiehl
>> ______________________________________________________
>>
>> Prof.Dr.Reinhold Kiehl, Gutachter und Berater
>> RKI-Institut, phone.094219298300
>>
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>> Wittelsbacherstr.27, 94315 Straubing
>>
>> *
>>
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>> Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals
>> during neuronal physiology and pathology _in vivo_
>>
>> * Michael O Breckwoldt [1],1 [2], 2 [3], 11 [4],
>> * Franz M J Pfister [5],1 [2], 2 [3],
>> * Peter M Bradley [6],2 [3],
>> * Petar Marinković [7],1 [2],
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>> * Daret K St Clair [12],3 [13],
>> * Ronald Naumann [14],4 [15],
>> * Oliver Griesbeck [16],5 [17],
>> * Markus Schwarzländer [18],6 [19],
>> * Leanne Godinho [20],1 [2],
>> * Florence M Bareyre [21],2 [3], 7 [22],
>> * Tobias P Dick [23],8 [24],
>> * Martin Kerschensteiner [25]2 [3], 7 [22], 12 [26],
>> * & Thomas Misgeld [27]1 [2], 7 [22], 9 [28], 10 [29], 12 [26],
>>
>> Prof. Thomas Misgeld MD
> Director, Institute of Neuronal Cell Biology (TUM-NCB)
> German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) - München
> Technische Universität München, Germany
> Biedersteiner Strasse 29
> 80802 München
> ++498941403512
>
thomas.misgeld@lrz.tum.de
>